相分離/相變

（Phase separation，Phase Transition）

相分離/相變是近幾年生化、細胞生物學新興且十分火熱的研究領(lǐng)域。Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)表了題為：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章，提出了細胞內(nèi)通過“相分離"，可以提供一種特定的方式讓細胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的"細胞內(nèi)部形成一定“秩序"，為困擾了大家多年的問題，提供了全新的思路。
 

分離或相變（Phase separation，Phase transition）描述的是細胞里不同成分間相互碰撞、融合形成液滴，從而使一些成分被包裹在液滴內(nèi)、一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象，就如同水油相混，細胞里的不同成分也會相互分離，形成液滴，這就是相分離。后續(xù)的大量研究也讓生物學家發(fā)現(xiàn)相分離在細胞生物學中無處不在。2011年，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne又發(fā)現(xiàn)核仁有液滴現(xiàn)象，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)分子間存在較弱的作用力，形成液滴類的物質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)存在相分離現(xiàn)象；至2018年CNS上已發(fā)表十幾篇重要級文章證實相分離的廣泛存在和重要性。
 

圖1. 細胞內(nèi)的油滴藝術(shù) 
 

細胞內(nèi)的相分離

細胞中存在各種無膜結(jié)構(gòu)的細胞器：顆粒、核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC及突觸的細胞骨架等，相分離廣泛發(fā)生于各種成分之間。
 

蛋白質(zhì)或RNA分子

蛋白質(zhì)或RNA分子間的物理作用力可以使它們相互分開或聚集。一旦分子達到一定濃度，它們就會發(fā)生相分離，相似的成分聚集在一起加速生物學反應（類似于相似相容），或者隔離無關(guān)的分子。
 

細胞膜上的信號傳遞

在神經(jīng)細胞中，細胞間進行信號傳遞時，蛋白質(zhì)在連接處的聚集和相分離是保證細胞間信號傳遞正常進行所必需的。
 

DNA折疊包裝

在細胞核中，相分離幫助壓縮折疊不使用的DNA并抑制其活性。一些可能與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白被阻隔在外。
 

液滴成為障礙 

在肌萎性脊髓側(cè)索硬化癥中，分離成液滴的蛋白質(zhì)會逐漸凝結(jié)、變硬，形成有害的固體物質(zhì)。

圖2. 細胞內(nèi)的相分離

相分離的主要應用

隨著相分離的研究逐漸增多，研究人員發(fā)現(xiàn)相分離在無膜器官的形成、信號轉(zhuǎn)導、細胞骨架、超分子組裝、基因激活等方面起著重要作用，相分離異常可能導致如神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、衰老等。
 

神經(jīng)退行性疾病

在肌萎側(cè)索硬化（ALS） （一種運動神經(jīng)元疾病） 中觀察到“相分離"，發(fā)現(xiàn)FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴，液滴粘性逐漸變強，最終形成纖維狀的固體，在ALS中異常沉積。
 

阿爾茨海默病患者腦內(nèi)異常沉積的tau蛋白也存在相分離，相分離可能是tau蛋白聚集的初始觸發(fā)因素。

圖3. FUS蛋白相分離作用圖解；FUS蛋白相分離熒光圖像
 

腫瘤

分子病理學家Miguel Rivera和他的團隊發(fā)現(xiàn)了一種與尤文氏肉瘤有關(guān)的蛋白。這種蛋白聚集在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因組附近時可激活致癌基因表達，而異常的相分離就可能促使這種蛋白在這些區(qū)域附近聚集。
 

細胞保護作用

Hyman和Alberti發(fā)現(xiàn)酵母細胞在低pH的壓力環(huán)境下，一些重要蛋白會聚集成液滴啟動保護機制。當pH回升后，這些液滴會分散開，細胞恢復正常的功能。
 

相分離研究中使用的主要技術(shù)

研究相分離涉及的相關(guān)步驟及技術(shù)有很多，首先通常會用到體外重構(gòu)相分離，通過將目標物質(zhì)表達純化，在體外重構(gòu)相分離的過程，證明存在相分離機制。其次，相分離研究的關(guān)鍵是要證明所研究的目標物質(zhì)（蛋白、RNA等）存在動態(tài)可逆的聚集-解聚狀態(tài)變化，并且這一變化與目標物質(zhì)的功能有關(guān)。因此如何證明這種動態(tài)變化狀態(tài)是關(guān)鍵。
 

這一過程包括觀察相分離的技術(shù)以及影響和調(diào)控相分離過程的技術(shù)，如：顯微成像技術(shù)、光調(diào)控系統(tǒng)（OptoDroplets、CasDrop）、溶液渾濁度檢測、離心沉淀法、表面張力測定（反毛細管速度+被動微流變學）、液滴內(nèi)部硬度測定（原子力顯微鏡或光鑷）、聚合物網(wǎng)格孔徑測定（熒光標記右旋糖苷）等。
 

顯微成像作為觀察相分離的主要技術(shù)，在相分離中發(fā)揮著*的作用。按觀察方式主要涉及明場光學顯微鏡和熒光顯微鏡。明場顯微鏡中主要通過微分干涉（DIC）、相差（PH）、偏光（POL）等方法觀察體外、無標記的相分離溶液，可獲得液滴形成過程、大小及隨時間變化、液滴內(nèi)部纖維性或固態(tài)樣結(jié)構(gòu)各項異性等結(jié)果。對于體外和體內(nèi)熒光標記的研究對象，則采用熒光顯微鏡去觀察并獲取高分辨的液滴形成過程、大小及隨時間變化的熒光圖像，以及分子擴散性和液滴內(nèi)部分子擴散能力等研究。
 

明場顯微鏡

運用明場顯微鏡DIC或者PH的功能，可以獲得：

• 液-液相分離形成的液滴，得到形成時間、輪廓大小、融合或裂變擴散等信息；

• 隨著加入藥物處理，可觀察液滴大小變化、融合或者裂變擴散。

如圖4，在DIC明場顯微鏡模式下觀察隨時間變化，液滴形態(tài)大小的變化。

圖4. DIC明場顯微鏡觀察相分離隨時間的變化過程 
 

熒光顯微鏡

因其分辨率高，能夠清晰觀察靜態(tài)液滴輪廓邊界以及亞細胞的分子結(jié)構(gòu)（如圖5），對于動態(tài)過程的采集，也能獲取更為清晰的圖像，是相分離成像的主要觀察手段。

圖5. 小鼠胚胎干細胞相分離免疫熒光圖像
 

圖6. HeLa細胞核中蛋白聚集、分離形成小液滴
 

激光共聚焦顯微鏡

除了上述檢測液滴輪廓、大小，融合裂變、分子結(jié)構(gòu)、定位等實驗外，在激光掃描共聚焦顯微鏡上還可以進一步利用熒光漂白后恢復實驗（FRAP）檢測液滴中的擴散行為。FRAP實驗原理是使用高強度激光將對選定區(qū)域進行漂白，然后觀測該區(qū)域熒光強度隨時間恢復的動力學過程。FRAP是非常有效的研究分子動力學變化的技術(shù)手段，它可檢測體外和體內(nèi)的相分離、可評估液滴內(nèi)部的同質(zhì)性，具備激光功率可控、靈活照明控制、靈活選擇漂白區(qū)域等*優(yōu)勢，在相分離研究中能發(fā)揮重要作用。基于共聚焦顯微鏡的FRAP實驗除了可以獲取高分辨圖像，還能獲取動態(tài)的漂白恢復曲線信息（如圖7），更好地評估相分離中的動力學過程。

圖7. 基于激光共聚焦顯微鏡的FRAP實驗研究相分離
 

如需觀察更為微觀的納米結(jié)構(gòu)，可以使用超高分辨共聚焦顯微鏡，實現(xiàn)50nm的解析精度，也可使用電子顯微鏡做進一步的結(jié)構(gòu)分析。